היחידה לקחה חלק במבצעים רבים כנגד ארגוני הטרור הפלסטיניים[8] באינתיפאדה השנייה[9]. בשנת 2004 ספגה היחידה הרוג ראשון במהלך פעילות מבצעית ברמאללה. הלוחם נהרג כתוצאה מירי דו-צדדי ולא על ידי מחבלים[10].
בנובמבר 2021 עצרו לוחמי היחידה כנופיה של 6 שודדי ביטקוין שנהגו לשדוד אנשים שרצו לקנות מטבעות ביטקוין בחיפה.[11][12]
ב-13 בנובמבר 2022 עצרו לוחמי היחידה יחד עם בלשי ימ"ר חוף 6 מעורבים ברצח מור טוויזר בטבריה, קריית אתא ובשכונת ג'ואריש ברמלה.[13][14]
בבוקר מתקפת הפתע על ישראל ב-7 באוקטובר2023, הוקפצו כלל לוחמי היחידה. עם התבררות ממדי האירוע, חולקו כוחות היחידה לארבעה צוותי פעולה מרכזיים שפעלו במקביל במספר גזרות:[16]
צוות ראשון של היחידה נע על כביש 232 לכיוון מפלסים.[16] בהגיעו לציר, נתקל הכוח באש כבדה, השיב באש וחיסל ארבעה מחבלים. בהמשך התקדם הכוח כמאתיים מטרים נוספים לעומק הציר לעבר מוקדי ירי נוספים, ובמהלך פריקת הלוחמים מהרכבים נפצעו שניים מהם.[16] תחת אש, שילב הכוח פעולות לחימה עם פינוי נפגעים, ובמהלך הקרבות באזור סעד ונחל עוז חילצו הלוחמים אזרחים וחיילים רבים.[16] במקביל, נשלח כוח שני של היחידה לכפר עזה בעקבות הדיווחים על חדירת מחבלים נרחבת לקיבוץ, בעוד כוח שלישי נפרס באזור אשקלון כדי לבלום חוליות מחבלים שנעו לעבר העיר.[16] כוח רביעי, שהורכב מחניכי קורס הלוחמים של היחידה, נפרס באזור רמלה כדי לשמש כוח בלימה ועתודה למקרה שהלחימה תתרחב למרכז הארץ.[16]
עם הגעת הכוח לקיבוץ כפר עזה, יצרו הלוחמים קשר עם תושב שהתבצר עם אשתו ההרה ותינוקם בתוך מרחב מוגן (ממ"ד), וחתרו להגיע לביתם.[16] בהגיעם למבנה, חברו לוחמי היחידה לכוח של שירות הביטחון הכללי (שב"כ) שניהל באותה עת ניסיון משא ומתן עם המחבלים ששהה בתוך הבית.[16] לאחר שמאמצי המשא ומתן נכשלו, הנחו הלוחמים את האזרח שבתוך הממ"ד לאחוז בחוזקה בידית הדלת כדי למנוע את פתיחתה מבחוץ, והשליכו רימון רסס לעבר חלל המבנה.[16] בפעולה זו חוסלו שני מחבלים ושלושה נוספים נתפסו חיים. המחבלים שנעצרו תוחקרו באופן מיידי בשטח על ידי כוחות הביטחון לצורך הפקת מודיעין טקטי להמשך הלחימה.[17]
במהלך מלחמת חרבות ברזל היחידה פעלה באופן שוטף בשיתוף פעולה עם שירות הביטחון הכללי לביצוע מעצרים של מבוקשים המעורבים בפעילות טרור בגזרת יהודה ושומרון.[18]
ב-21 ביוני 2024, השתתפו לוחמי היחידה במבצע משותף עם צה"ל ובהכוונת השב"כ בקלקיליה, במטרה לעצור שני פעילי הג'יהאד האסלאמי, שאחד מהם תכנן לבצע פיגוע בטווח הזמן המיידי.[19]במהלך ניסיון המעצר פתחו המבוקשים באש לעבר הכוחות, ובתגובה השיבו הלוחמים בירי וחיסלו את שני המחבלים.[20]
באוגוסט 2025 לוחמי יחידת הגדעונים 33 , ובהכוונה מודיעינית של שב"כ, פעלו למעצרו של חשוד המזוהה עם תנועת פתח-תנזים, שביצע פיגוע ירי בדרום הר חברון והוגדר כמבוקש
אחת לשנה מגייסת היחידה לוחמים לשורותיה לאחר מעבר כשירות רפואית, מבחנים, ראיון וגיבוש. לוחמי היחידה הם יוצאי כוחות מיוחדים של צה"ל, ימ"ס , או בוגרי קורס פיקודי/קצינים בצה"ל.
תהליך הגיוס ליחידה 33 ראשיתו בלשכת הגיוס של משטרת ישראל. מועמדים שנמצאו מתאימים בשלב הסינון הראשוני מוזמנים לוועדת קבלה, שמטרתה להתרשם מיכולותיהם הכלליות ולבחון את מידת התאמתם לאופי היחידה. העוברים שלב זה ממשיכים לגיבוש הנערך ב"מרכז הערכה" בתנאי פנימייה. שלב זה נועד לבחון, בין היתר, את כושרם הגופני של המועמדים, תפקודם במצבי לחץ, התמודדותם עם תנאי עייפות ומחסור בשינה, וכן את רמת המוטיבציה והנחישות שלהם.[23]
מועמדים הצולחים את מרכז ההערכה נדרשים לעבור סדרת מבחנים נוספת, הבוחנת כישורים קוגניטיביים ומנטליים כגון כושר התמצאות במרחב, יצירתיות, זיכרון ויכולות למידה. השלב הסופי בתהליך המיון כולל בדיקות התאמה ביטחונית לצורך קבלת סיווג ביטחוני.[23]
קורס ההכשרה ללוחמים ביחידת הגדעונים נמשך תשעה חודשים. ההכשרה מתקיימת בתנאי פנימייה ומיועדת להקנות ללוחמים את היכולות הטכנולוגיות החדישות ומיומנויות הלחימה המתקדמות הנדרשות לפעילות סמויה ואיסוף מודיעין.[23]