מערכת הגבלה-שינוי
פעולות נוספות
| תמונה תלת־ממדית של מערכת הגבלה-שינוי. אפשר להקיש על התמונה ולסובב עם מקש שמאלי בעכבר לכל הכיוונים, כדי לראות את המבנה המדויק | |
| קישור סינפטי | {{#property:P926}} |
|---|---|
| עצבוב | {{#property:P3190}} |
מערכת הגבלה-שינוי (מערכת RM, restriction modification) מצויה בחיידקים ובאורגניזמים פרוקריוטיים אחרים, ומספקת הגנה מפני DNA זר, כמו זה שנושאים בקטריופאגים.
לחיידקים יש אנזימי הגבלה, הנקראים גם אנדונוקלאזים (אנ') של הגבלה, שמבקעים DNA דו-גדילי בנקודות ספציפיות למקטעים. את המקטעים האלה מפוררים לאחר מכן אנדונוקלאזים אחרים. גורם זיהומי כגון בקטריופאג מכניס לעיתים DNA זר, והמערכת הזו מונעת זיהום על ידי הרס ה-DNA הזר הזה. לרבע מהחיידקים המוכרים יש מערכות הגבלה-שינוי ומתוכם לכמחצית יש יותר מסוג אחד של מערכת.
רצפי DNA שאנזימי ההגבלה מכירים הם קצרים מאוד, ולכן החיידק עצמו יכיל כמעט בוודאות חלק מהם בגנום שלו. על מנת למנוע הרס של ה-DNA שלו-עצמו על ידי אנזימי ההגבלה, מתווספות קבוצות מתיל. אסור ששינויים אלה יפריעו לזיווג בסיסי ה-DNA, ולכן, בדרך כלל רק כמה בסיסים ספציפיים משתנים בכל גדיל.
אנדונוקלאזים מבקעים קשרים פוספודיאסטרים פנימיים (כלומר, שאינם בקצות הרצף). הם עושים זאת רק לאחר זיהוי רצפים ספציפיים ב-DNA שהם בדרך כלל באורך 4–6 זוגות בסיסים, ולעיתים קרובות פלינדרומיים.
היסטוריה עריכה
מערכת ההגבלה-שינוי התגלתה לראשונה על ידי סלבדור לוריא ומרי הומאן (Human) ב-1952 וב-1953.[1][2] הם מצאו שבקטריופאג הגדל בתוך חיידק נגוע ועובר שינוי (מודיפיקציה), כך שעם שחרורו והדבקה מחדש של חיידק דומה, גדילת הבקטריופאג נבלמת.[3]
בשנת 1953, ז'אן וייגל (Weigle) וג'וזפה ברטאני (Bertani) דיווחו על דוגמאות דומות של שינוי המבוקר על ידי המארח באמצעות מערכת בקטריופאגים שונה.[4] מחקרים של דייזי רולן-דוסואה (Roulland-Dussoix) וורנר ארבר ב-1962[5] וחוקרים נוספים לאחר מכן, הביאו להבנה שההגבלה נובעת מהתקפה ופירוק של ה-DNA של הבקטריופאג הפולש על ידי אנזימים ספציפיים של החיידקים המקבלים.
עבודה נוספת של המילטון או. סמית' בודדה את HinDII, הראשון מקבוצת האנזימים הידועים כיום כאנזימי הגבלה, בעוד דניאל נתנס הראה שניתן להשתמש בו למיפוי הגבלה.[6] כאשר אנזימים אלו בודדו במעבדה הם יכלו לשמש למניפולציה מבוקרת של DNA, ובכך לספק את הבסיס לפיתוח הנדסה גנטית. ורנר ארבר, דניאל נתנס והמילטון סמית' זכו בפרס נובל לפיזיולוגיה או רפואה בשנת 1978 על עבודתם בנושא הגבלה.
סוגים עריכה
יש ארבע קטגוריות של מערכות להגבלה-שינוי: סוג I, סוג II, סוג III וסוג IV, כולן עם פעילות אנזים הגבלה ופעילות מתילאז (אנזימי מתילציה, פרט לסוג IV שאין לו פעילות מתילאז). הם נקראו לפי סדר הגילוי, אם כי המערכת מסוג II היא הנפוצה ביותר.[7]
מערכות מסוג I הן המורכבות ביותר, והן מורכבות משלושה פוליפפטידים: R (הגבלה), M (שינוי) ו-S (ספציפיות). הקומפלקס המתקבל יכול גם לבקע את ה-DNA ולעשות לו מתילציה. שתי התגובות מצריכות ATP, ולעיתים קרובות מתרחש ביקוע במרחק ניכר מאתר הזיהוי. תת-יחידת ה-S קובעת את הספציפיות של ההגבלה וגם של המתילציה. החיתוך מתרחש במרחקים משתנים מרצף הזיהוי, כך שרצועות נפרדות אינן ניתנות לצפייה בקלות על ידי אלקטרופורזה של ג'ל.[דרוש מקור]
מערכות מסוג II הן הפשוטות והנפוצות ביותר.[8] במקום לעבוד כקומפלקס, המתילטרנספראז והאנדונוקלאז מקודדים כשני חלבונים נפרדים ופועלים באופן עצמאי (אין חלבון ספציפי). שני החלבונים מזהים את אותו אתר זיהוי, ולכן מתחרים על פעילות. המתילטרנספראז (אנ') פועל כמונומר, ועושה מתילציה לדופלקס לגדיל אחד בכל פעם. האנדונוקלאז פועל כהומודימר (צורה של מבנה רביעוני של חלבונים זהים(אנ')), מה שמקל על ביקוע שני הגדילים. ביקוע מתרחש במיקום מוגדר קרוב לרצף הזיהוי או בתוכו, וכך מייצר שברים נפרדים במהלך אלקטרופורזה של ג'ל. מסיבה זו, מערכות מסוג II משמשות במעבדות לניתוח DNA ושיבוט גנים.[דרוש מקור]
למערכות מסוג III יש חלבונים מסוג R (res) ו-M (mod) שיוצרים קומפלקס של שינוי וחיתוך. חלבון M, עם זאת, יכול לעשות מתילציה באופן עצמאי. המתילציה מתרחשת רק על גדיל אחד של ה-DNA, בניגוד לרוב המנגנונים הידועים האחרים. הקומפלקס שנוצר על ידי חלבוני R ו-M מבצע בו-זמנית פעולות סותרות על ידי שינוי וחיתוך באותה תגובה. זה גורם לעיכול (חיתוך) לא מלא של ה-DNA.[9][10]
מערכות מסוג IV אינן מערכות הגבלה-שינוי אמיתיות מכיוון שהן מכילות רק אנזים הגבלה ולא מתילאז. בניגוד לסוגים האחרים, אנזימי הגבלה מסוג IV מזהים וחותכים רק DNA שעבר שינוי (מודיפיקציה).[11]
תפקיד עריכה
למנינגוקוקוס (Neisseria meningitidis) יש מספר מערכות אנדונוקלאזות הגבלה מסוג II המועסקות בטרנספורמציה גנטית טבעית. טרנספורמציה גנטית טבעית היא תהליך שבו תא חיידקי מקבל יכול לקלוט DNA מתא חיידקי תורם שכן ולשלב את ה-DNA הזה בגנום שלו על ידי רקומבינציה. מחקר מוקדם על מערכות הגבלה-שינוי התמקד בתועלת לחיידקים בהגנה על עצמם מפני DNA פולש של בקטריופאג או DNA זר אחר, אך כיום ידוע שניתן להשתמש במערכות אלו גם כדי להגביל את ה-DNA המוכנס על ידי טרנספורמציה טבעית מחברים אחרים של אותו מין, או ממינים קשורים.[דרוש מקור]
במנינגוקוקוס, יכולת הטרנספורמציה היא תהליך מפותח ומורכב שבו חלבונים מרובים על פני החיידק, בממברנות ובציטופלזמה, מקיימים אינטראקציה עם ה-DNA הנכנס. מערכות להגבלה-שינוי נמצאות בשפע בחיידק זה. יש לו מספר מערכות אנדונוקלאזות הגבלה מסוג II.[12] הספציפיות במערכות הגבלה-שינוי משתנות בין קלאדים שונים.[12][13] הספציפיות הזו מספקת מחסום יעיל נגד חילופי DNA בין הקלאדים.[12] לוריא[3] התייחס להתנהגות מגבלה כזו כ"מקרה קיצוני של חוסר ידידותיות". הגבלה-שינוי נראית כמניע עיקרי של בידוד מיני והתמיינות במנינגוקוקוס.[14] קוגנט ומיידן (Caugant and Maiden)[15] הציעו כי מערכות הגבלה-שינוי במנינגוקוקוס עשויות לפעול כדי לאפשר החלפה גנטית בקרב קרובי משפחה תוך הפחתה (אך ללא מניעה מוחלטת) של החלפה גנטית בין מנינגוקוקים השייכים לקומפלקסים שונים של שיבוטים שונים, ולמינים קשורים.[דרוש מקור]
מערכות הגבלה-שינוי יכולות לפעול גם כאלמנטים גנטיים אנוכיים, ולכפות על התא את תחזוקתן באמצעות הרג תאים לאחר הפרדה (Post-segregational killing).[16]
כמה נגיפים פיתחו דרכים לחתור תחת מערכת הגבלה-שינוי, בדרך כלל על ידי שינוי ה-DNA שלהם, על ידי הוספת קבוצות מתיל או גליקוזיל אליו, וכך חסימת אנזימי ההגבלה. נגיפים אחרים, כמו בקטריופאג'ים T3 ו-T7, מקודדים חלבונים המעכבים את אנזימי ההגבלה.[דרוש מקור]
כדי לנטרל את הנגיפים הללו, חלק מהחיידקים פיתחו מערכות הגבלה אשר מזהות ומנתקות רק DNA שעברו שינוי (מודיפיקציה), אך אינן פועלות על ה-DNA הרגיל של המארח. חלק מהפרוקריוטים פיתחו סוגים רבים של מערכות להגבלה-שינוי.[דרוש מקור]
מערכות הגבלה-שינוי נמצאות בשפע יותר במינים "מופקרים" (בעלי ניידות גנטית גבוהה), שבהם הן מבססות נתיבים מועדפים של חילוף גנטי בתוך ובין שושלות עם מערכות הגבלה-שינוי קשורות.[17] מכיוון שהרפרטואר או הספציפיות של מערכות הגבלה-שינוי בשושלות חיידקים משתנים במהירות, השטפים המועדפים של העברה גנטית בתוך מינים צפויים להשתנות ללא הרף, וליצור רשתות תלויות זמן של העברת גנים.[דרוש מקור]
יישומים עריכה
ביולוגיה מולקולרית עריכה
(א) שיבוט: ניתן לשבט מערכות הגבלה-שינוי לתוך פלסמידים ולבצע בהם ברירה מלאכותית בזכות העמידות שמספק אנזים המתילציה. ברגע שהפלסמיד יתחיל להשתכפל, אנזים המתילציה יתחיל להיות מיוצר ויעשה מתילציה של ה-DNA של הפלסמיד, וכך גם יגן על גנום המארח מפני אנזים הגבלה ספציפי.[דרוש מקור]
(ב) פולימורפיזמים של אורך מקטע הגבלה: אנזימי הגבלה משמשים גם לניתוח ההרכב של ה-DNA בהתייחס לנוכחות או היעדר מוטציות המשפיעות על הספציפיות של חיתוך אנזימי הגבלה. כאשר משווים בין גני-בר לבין גנום מוטנטי(אנ') על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה שונים, תוצרי ההפרדה באלקטרופורזת ג'ל יהיו שונים באורכם, בעיקר כי גנים מוטנטים לא מתפצלים בדפוס דומה כמו גני-בר, זאת משום שמוטציה באתר הזיהוי מונעת מהאנזים לבצע חיתוך באותה נקודה, מה שיוצר מקטעי DNA ארוכים או קצרים יותר בהשוואה לדפוס החיתוך המקורי.[דרוש מקור]
טכניקה זו מנצלת את העובדה שאנזימי הגבלה הם בעלי ספציפיות גבוהה מאוד לרצף מסוים, לכן, כל שינוי (מוטציה) ברצף המטרה יגרום לאנזים להחטיא את האתר ולא לחתוך אותו, מה שמאפשר לחוקרים לזהות וריאציות גנטיות בקלות.
טיפול גנטי עריכה
מערכת הגבלה-שינוי אצל החיידקים הוצעה כמודל לפיתוח חיסונים וטיפולים אנטי-ויראליים אנושיים או גנומיים מאחר שמערכת זו מגינה על חיידקים על ידי הגבלת הטרופיזם של בקטריופאגים.[18] המחקר הוא על אנזימי הגבלה ו-ZFN (חלבוני אצבעות אבץ(אנ')) שיכולים לפצל את ה-DNA של נגיפים אנושיים שונים, כולל HSV-2, פפילומה בסיכון גבוה ונגיף האיידס HIV-1, במטרה לגרום למוטגנזה מכוונת ולשיבושים של נגיפים שמדביקים בני אדם.[19][20][21] הגנום האנושי מכיל כבר עתה שרידי גנומים רטרו-ויראליים שהושבתו וגויסו לטובת המארח. למעשה, המנגנונים להשתקת רטרו-אלמנטים גנומיים פעילים מסוג L1 על ידי האנזימים TREX1 (three prime repair exonuclease 1) ו-ERCC1 (excision repair cross complementing 1), נראים כמי שמחקים את פעולת מערכות ההגבלה-שינוי בחיידקים, ואת תהליך חיבור הקצוות הלא-הומולוגי (NHEJ) המתרחש בעקבות השימוש ב-ZFN ללא תבנית תיקון.[22][23]
התקדמות גדולה היא יצירת אנזימי הגבלה מלאכותיים על ידי קישור דומיין החיתוך של הדנ"א של אנזים ההגבלה FokI עם מערך של חלבונים קושרים ל-DNA, או מערכי אצבעות אבץ (zinc finger), המכונים נוקלאזות אצבעות אבץ (ZFN).[24] אלה הם כלים רבי עוצמה לעריכת הגנום המארח בשל סגוליות הרצף המשופרת שלהם. הם עובדים בזוגות, הדימריזציה שלהם מתווכת במקום, באתר, באמצעות תחום אנזים ההגבלה FokI. כל מערך אצבעות האבץ מסוגל לזהות 9–12 זוגות בסיסים, מה שמייצר 18–24 עבור הזוג. מרווח של 5–7 זוגות בסיסים (bp) בין אתרי הזיהוי משפר עוד יותר את הספציפיות של ZFN, מה שהופך אותם לכלי בטוח ומדויק יותר שניתן ליישם על בני אדם. נערך ניסוי קליני שלב I של אצבעות אבץ לביטול ממוקד של הקולטן המשותף CCR5 ל-HIV-1.[25]
הקשר של מערכת הגבלה-שינוי עם אלמנטים גנטיים ניידים (MGE) עריכה
מערכות הגבלה-שינוי הן שחקנים מרכזיים באינטראקציה הקו-אבולוציונית בין אלמנטים גנטיים ניידים (MGEs) לבין המארחים שלהם.[26] גנים שמקודדים מערכות הגבלה-שינוי נעים בין גנומים פרוקריוטיים בתוך אלמנטים גנטיים ניידים כגון פלסמידים, פרופאגים (אנ') (גנום של בקטריופאג), רצפי החדרה/טרנספוזונים, אלמנטים מצמדים אינטגרטיביים (ICEs)(אנ') ואינטגרונים. עם זאת, לאחרונה נמצא כי ישנן מעט מערכות הגבלה-שינוי בפלסמידים, חלקן בפרופאגים ואף אחת בפאגים. מצד שני, כל האלמנטים הגנטיים הניידים הללו מקודדים מספר רב של גנים בודדים של מערכות הגבלה-שינוי, בעיקר MTases (DNA methyltransferase - אנזימי מתילטרנספראז).[26] לאור זאת, סביר להניח שניידות מערכת הגבלה-שינוי עשויה להיות פחות תלויה באלמנטים גנטיים ניידים ויותר תלויה, למשל, בקיומן של נקודות חמות קטנות של אינטגרציה גנומית. ייתכן גם שמערכות הגבלה-שינוי מנצלות לעיתים קרובות מנגנונים אחרים כגון טרנספורמציה טבעית, שלפוחיות, ננו-צינוריות, סוכני העברת גנים או התמרה כללית על מנת לעבור בין גנומים.[דרוש מקור]
ראו גם עריכה
הערות שוליים עריכה
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ 1 2 Salvator E Luria. A Slot Machine, A Broken Test Tube: An Autobiography. Harper & Row, New York: 1984. Pp. 228. מסת"ב 0-06-015260-5 (USA and Canada)
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ Wil A. M. Loenen, David T. F. Dryden, Elisabeth A. Raleigh, Geoffrey G. Wilson, Noreen E. Murray, Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes, Nucleic Acids Research 42, 2014-01-01, עמ' 3–19 doi: 10.1093/nar/gkt990
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ 1 2 3 שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).
- ^ 1 2 שגיאת לואה ביחידה יחידה:Citation/CS1/Configuration בשורה 1739<includeonly></includeonly>: attempt to index field '?' (a nil value).